A1: 目前培養的類(lèi)器官主要來(lái)源于上皮細胞，對于非上皮細胞來(lái)源的類(lèi)器官培養方式還需要進(jìn)一步研究。

A2: 常見(jiàn)的類(lèi)器官根據起始細胞的類(lèi)型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來(lái)源的腫瘤類(lèi)器官；

（2）干細胞來(lái)源的類(lèi)器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。

A3: 類(lèi)器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質(zhì)的起始細胞進(jìn)行分裂和分化，并將多種類(lèi)型的細胞自組裝的結構，自組裝后的形態(tài)和功能與體內相應器官相似。

A4：可以的。已有學(xué)者驗證過(guò)，將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后，以梯度降溫的方式進(jìn)行冷凍，最終在液氮中保存15-18個(gè)月后進(jìn)行復蘇和原代細胞提取，分別對細胞進(jìn)行2D和3D培養，證實(shí)了凍存對于細胞活力和生長(cháng)速度均無(wú)顯著(zhù)影響^【1】。

當然，由于組織來(lái)源不同、凍存條件不同，還需要大家根據實(shí)際情況進(jìn)行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養的最佳選擇。

A5：類(lèi)器官可以?xún)龃?，通常?huì )在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類(lèi)器官成熟（傳代7-10次）后再進(jìn)行凍存。

A6：是的，主要的原因是類(lèi)器官內部缺乏循環(huán)系統。

當類(lèi)器官的尺寸較大時(shí)，靠近中心的細胞難以和外界進(jìn)行氧氣和營(yíng)養成分的交換。因此這個(gè)結構尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養的過(guò)程中，需要控制類(lèi)器官的大小在4-5mm以?xún)?。未?lái)的類(lèi)器官技術(shù)可以與血管類(lèi)器官結合在一起，建立一個(gè)功能性的封閉循環(huán)系統，用以培養出更大尺寸的類(lèi)器官。

A7：類(lèi)器官的傳代通常是根據培養的時(shí)間判斷。一般在7-14天時(shí)進(jìn)行第一次傳代，后續則每7-10天傳代一次^【3】。

A8：大部分類(lèi)器官可以在體外連續傳代10次（>6個(gè)月），甚至有些類(lèi)器官可以連續傳代20次（>12個(gè)月）并且維持原有的生長(cháng)速度^【4】。

A9: 初步可以通過(guò)顯微鏡和H&E染色觀(guān)察形態(tài)；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術(shù)檢測該類(lèi)器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養的類(lèi)器官是否有某些特征丟失；對于部分類(lèi)器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類(lèi)器官可以分泌胃酸，心臟類(lèi)器官可以自主跳動(dòng)。

A10: 在進(jìn)行類(lèi)器官培養前，我們需要了解該器官在體內的發(fā)育過(guò)程，及早期發(fā)育相關(guān)的信號通路。

以胃類(lèi)器官培養為例：胃由前后腸發(fā)育而來(lái)，早期發(fā)育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過(guò)添加細胞因子的方式，指導激活/抑制相應的信號通路，來(lái)達到相同的效果，如：PSCs在A(yíng)ctivin A的作用下分化為內胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化^【5】。

A1: 類(lèi)器官是由不同類(lèi)型的細胞組成的結構，并且在體外是自組裝的，因此很容易存在同一樣本在相同培養條件下的孔間差異。

如果是用于患者個(gè)性化醫療的腫瘤類(lèi)器官，需要更精準地模擬患者體內的特征，這種情況建議采用多個(gè)平行來(lái)減小差異；

如果是用于機制研究或用作疾病模型的類(lèi)器官，可以考慮利用“微流控液滴技術(shù)”進(jìn)行工程化培養，相關(guān)成果已發(fā)表在Cell Reports Medicine^【1】。

A2：已有動(dòng)物實(shí)驗證實(shí)過(guò)可行性，比如：腸類(lèi)器官移植小鼠治療潰瘍性結腸炎^【2】；胰島類(lèi)器官移植小鼠治療糖尿病^【3】。

雖然目前類(lèi)器官移植尚未進(jìn)入臨床，但在2021年2月，Science^【4】首次報道了利用膽道類(lèi)器官修復離體條件下的人類(lèi)肝臟，實(shí)現了膽道再生，并改善了膽汁性質(zhì)。

A3：這個(gè)問(wèn)題可以在Nature Protocols^【5】找到答案。

對于新鮮培養的類(lèi)器官：建議對低代次類(lèi)器官（2-3代）進(jìn)行藥物篩選，以最大限度地減少使用過(guò)的培養基或體外突變累積對藥物測試的影響。

對于經(jīng)過(guò)凍存的類(lèi)器官：由于冷凍/解凍可能導致復蘇時(shí)器官樣形態(tài)的變化，因此建議類(lèi)器官至少傳代一次再進(jìn)行藥物篩選。如果出現復蘇后細胞活力不佳，則需要延長(cháng)培養時(shí)間以恢復細胞狀態(tài)。

A4：1、判斷形態(tài)。顯微鏡下類(lèi)器官形態(tài)可能為空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等，但整體形態(tài)一致。

2、可以鑒定相應的biomarker是否有表達，及分布是否與組織切片相似。

3、是否能夠傳代3次以上，并可以?xún)龃鎻吞K。

4、如果有條件的話(huà)，可以進(jìn)行測序分析。

A5：可以，干細胞來(lái)源類(lèi)器官的基因編輯多用于疾病建模，而腫瘤來(lái)源的類(lèi)器官則多用于尋找疾病相關(guān)突變點(diǎn)或治療靶點(diǎn)，圖1列舉了類(lèi)器官基因編輯的部分研究和應用。

A6：1、細胞來(lái)源有區別：類(lèi)器官的細胞來(lái)源是具有多能性的上皮細胞，而普通細胞培養適用于培養多種類(lèi)型細胞；

2、 細胞培養方式不同：1）類(lèi)器官需要基質(zhì)膠等材料支撐其三維結構，普通細胞培養則不需要；2） 類(lèi)器官需要實(shí)現體外分化和自組裝，因此需要多種細胞因子的組合進(jìn)行誘導，培養基成分復雜。而普通細胞培養通常為單一種類(lèi)細胞，因此培養基成分較簡(jiǎn)單；

A7：通常來(lái)講，如果腫瘤發(fā)生了轉移，我們依然選用相對應的原發(fā)灶（A類(lèi)型）PDO培養基。

A8：類(lèi)器官的分化方式本質(zhì)上是在模擬體內的器官發(fā)育，因此表達形態(tài)及各細胞分布情況與實(shí)際器官具有相似性，而細胞團則沒(méi)有這種規律。我們可以通過(guò)免疫熒光的方式檢測biomarkers的分布情況來(lái)區分。例如下圖中的結果表明，腎類(lèi)器官與腎組織的biomarkers分布高度一致^【7】。

A9：由于類(lèi)器官涉及到體外分化和自組裝，因此來(lái)源細胞必須具有多能性。正常組織的成熟體細胞中往往會(huì )有一部分成體干細胞（標志物為L(cháng)gr5，CD133等），這部分細胞也可以進(jìn)行類(lèi)器官培養。

A10：依據Hans Clevers實(shí)驗室早期發(fā)表的文章，可以采用條件性培養基代替純化的細胞因子進(jìn)行類(lèi)器官培養，但同時(shí)也需要考慮條件性培養基的不足之處。小編總結了條件性培養基和近岸細胞因子的參數差異。

A2：考慮到DMSO這類(lèi)有機物的細胞毒性，建議終濃度不超過(guò)0.1%（v/v）。

A3：黑色小顆粒大概率是雜質(zhì)或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：

1、將類(lèi)器官消化下來(lái)，用培養基進(jìn)行反復清洗，達到稀釋雜質(zhì)的作用；

2、用無(wú)菌手術(shù)刀將類(lèi)器官切成兩半，取1ml注射器吸滿(mǎn)培養基并輕輕推出，沖洗類(lèi)器官中的雜質(zhì)^【2】。

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優(yōu)勢，通常有以下兩種結合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性?xún)r(jià)比更高的方式，即：先利用PDO進(jìn)行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進(jìn)行PDX測試。

2、PDX-PDXO是更精準的藥物測試方式，即：先利用PDX產(chǎn)生大量的體內腫瘤，然后將這些腫瘤分離進(jìn)行PDXO培養，此時(shí)可以通過(guò)PDX模型，將PDXO的藥敏實(shí)驗結果與體內用藥結果一一對應，進(jìn)而預測人體用藥的結果，實(shí)現對患者更精準的用藥指導；并且可以用PDX模型將轉移后的腫瘤分離，同樣進(jìn)行PDXO培養和用藥，能夠更精確地對轉移灶進(jìn)行藥物篩選。

A5：1、將類(lèi)器官放置在冰上，待基質(zhì)膠融化后離心進(jìn)行回收，這種方式適用于不需要將類(lèi)器官結構完全打散的情況；

2、市售的細胞回收液，可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會(huì )損傷細胞或細胞表面蛋白。

A6：基質(zhì)膠能夠為類(lèi)器官提供支撐作用，目前類(lèi)器官培養用的基質(zhì)膠來(lái)源于小鼠肉瘤的基底膜基質(zhì)，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長(cháng)因子、類(lèi)胰島素生長(cháng)因子、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質(zhì)。由于基質(zhì)膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質(zhì)膠替代方案的研究，如圖2^【3】。

A7：1、根據所模擬的器官自身生長(cháng)情況選擇，例如：皮膚的正常生長(cháng)是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類(lèi)器官的培養傾向于利用氣-液交互法來(lái)培養^【4】；

2、考慮所培養的類(lèi)器官模型的應用方向，例如：氣-液交互法培養易于進(jìn)行病毒感染實(shí)驗，因此用于病毒感染實(shí)驗的氣道類(lèi)器官會(huì )優(yōu)先選擇氣-液交互法培養^【5】。

A8：藥物篩選前，通常將類(lèi)器官吹散后，用含2%-5%基質(zhì)膠的培養基懸浮，并最終鋪在基質(zhì)膠包被的孔板中^【6-7】。

A9：建議采用水平轉子代替角轉子，可以有效減少類(lèi)器官掛在離心管壁的情況。

A10：1、抗體藥物因為需要免疫細胞的參與，因此腫瘤類(lèi)器官不能篩選抗體類(lèi)藥物，此類(lèi)藥物篩選需要構建腫瘤類(lèi)器官-腫瘤微環(huán)境的模型來(lái)實(shí)現；

2、由于腫瘤類(lèi)器官中沒(méi)有對血管進(jìn)行培養，因此抗血管類(lèi)的藥物也同樣不能進(jìn)行篩選。